Am 21. April 1942 der erste Transport nach Theresienstadt abfuhr. Laut Plan sollte der Transport bereits Anfang März aufgebrochen sein, aufgrund einer Typhus-Epidemie und Überfüllung waren die Tore des Ghettos jedoch geschlossen worden, was Eichmann zur Verschiebung der Abfahrt zwang. Um das träge Tempo eines Sonderdeportationszugs zu vermeiden, der gewöhnlich mehrere Tage im Transit benötigte, schlug die Eisenbahnverwaltung in Utrecht vor, die Juden in Passagierwaggons zu befördern, die an einen regulären, mit normaler Geschwindigkeit fahrenden Zug gekoppelt würden. Der Reichskommissar der Niederlande, Arthur Seyss-Inquart, hatte zudem Interesse daran, die Deportation aus den Niederlanden nach Theresienstadt als „Wohnsitzverlegung“ darzustellen und daraus propagandistischen Nutzen zu ziehen. Daher schlug er vor, der Zug solle direkt in Amsterdam und nicht im Durchgangslager Westerbork abfahren. Eichmann hatte dagegen nichts einzuwenden.
Die Entscheidung über Schicksal und Ziel des Transports sowie die Richtlinien hinsichtlich der Kategorien von Juden, die die Passagierliste bestimmten, kamen aus Eichmanns RSHA-Referat. Die Information wurde an Zöpf in Den Haag weitergeleitet, der für die Durchführung des Transports verantwortlich war. Zöpf teilte sie mit Aus der Fünten und den Kommandanten der Lager Westerbork und Vught sowie den Zweigstellen in den Provinzen, die den Transfer der Juden aus ihren Distrikten nach Westerbork zu übernehmen hatten. Danach wurde die Deportationsliste für den Transport erstellt; sie wurde mehrmals überarbeitet, und jedes Mal, wenn neue Namen hinzugefügt wurden, musste die Genehmigung von Seyss-Inquart, Rauter und Wilhelm Harster, dem Befehlshaber der Sicherheitspolizei und des SD (BdS), eingeholt werden. Wenngleich auf der letzten Liste die Namen von 362 Personen standen, brachen nur 295 nach Theresienstadt auf. Aus der Fünten erklärte die Gründe für diese Disparität damit, dass einige der gelisteten Juden bereits Auschwitz erreicht hätten, während andere gestorben oder zuvor aus den Provinzen vertrieben worden seien und daher die Deportationsbefehle nicht erhalten oder es nicht rechtzeitig nach Westerbork geschafft hätten.
Zu den unterschiedlichen Gruppen von Juden, die auf der Deportationsliste standen, gehörte die jener prominenter Persönlichkeiten, die im zivilen Bereich „Friedensverdienste“ um das Reich aufweisen konnten. Die meisten von ihnen waren deutsche Juden, etwa der frühere Richter Fritz Rathenau, der während der Weimarer Republik zu den hochrangigsten Beamten im preußischen Innenministerium gehört hatte. Die wenigen niederländischen Juden, die in diese Kategorie mit einbezogen wurden, hatten lange Jahre Dienst für deutsche Einrichtungen in den Niederlanden geleistet, so wie Rossji Manheim, die Sekretärin des früheren deutschen Kronprinzen. Bei anderen handelte es sich um ehemalige Mitglieder der 'Nationaal Socialistische Beweging (NSB) oder um Nutznießer des persönlichen Schutzes des Parteiführers Anton Mussert. Ihre Namen und die ihrer Familienmitglieder wurden auf einer geheimen Liste verzeichnet und in der Registratur mit einem blauen Reiter versehen. Einer dieser Juden war der berühmte Cartoonist Jo Spier. Die Frage, wie die NSB-Juden zu behandeln seien, stellte die Nazis vor einige Schwierigkeiten. Eichmann wies einen Vorschlag zurück, der ihnen die Auswanderung gestattet hätte, und entschied stattdessen, sie sollten zu den letzten gehören, die deportiert würden. Ausserdem umfasste der Transport auch Kriegsveteranen und ihre Familien sowie Partner aus inzwischen aufgelösten Mischehen....